Follow by Email

Τετάρτη, 7 Δεκεμβρίου 2011

Πρώτη αναφορά των Botrytis cinerea, Penicillium glabrum, Aspergilus niger var. tubigensis και Pilidiella granati ως παθογόνα σήψεων καρπών ροδιάς (Punica granatum) στην Ελλάδα


Εισαγωγή
Την τελευταία δεκαετία και ιδιαίτερα μετά τις πρόσφατες διαπιστώσεις σχετικά με τη σημασία των αντιοξειδωτικών ουσιών, που περιέχονται σε υψηλή περιεκτικότητα στους καρπούς και το χυμό του ροδιού, για την ανθρώπινη υγεία, η καλλιέργεια της ροδιάς εμφανίζει ιδιαίτερη ανάπτυξη.
Υλικά – Μέθοδοι
Συλλογή φυτοπαθογόνων μυκήτων:
Το χρονικό διάστημα Σεπτέμβριος – Οκτώβριος 2008 παρατηρήθηκαν στην περιοχή της Λάρισας προσυλλεκτικές και μετασυλλεκτικές σήψεις σε καρπούς ροδιάς (ποικιλία Καμπαδίτικα), με εκτιμώμενα ποσοστά προσβολής της τάξης του 10 – 20%. Από προσβεβλημένους καρπούς που προσκομίστηκαν στο Εργαστήριο Φυτοπαθολογίας του Α.Π.Θ. έγιναν απομονώσεις των αιτίων των σήψεων.
Ταυτοποίηση φυτοπαθογόνων μυκήτων:
Οι μύκητες που απομονώθηκαν ταυτοποιήθηκαν με βάση τα μορφολογικά χαρακτηριστικά των αποικιών και των καρποφοριών τους καθώς και με αλληλούχιση των ITS1 και ITS2 περιοχών του ριβοσωμικού DNA.
Απομόνωση μυκήτων
Η απομόνωση των φυτοπαθογόνων μυκήτων πραγματοποιήθηκε με μεταφορά μολυσμένων φυτικών ιστών ή/και κονιδίων και κονιδιοφόρων από την εσωτερική περιοχή της σήψης σε οξινισμένα τριβλία με PDA. Ακολουθούσε η μεταφορά ακραίων τμημάτων νεαρών μυκηλιακών υφών σε νέα τριβλία με PDA.
Μοριακός χαρακτηρισμός φυτοπαθογόνων μυκήτων
Απομόνωση, καθαρισμός και αλληλούχιση DNA: Η απομόνωση του DNA πραγματοποιήθηκε με τη βοήθεια του Qiagen Puregene Core Kit A (QIAGEN GmbH, Hilden, Germany) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Οι μη μεταγραφόμενες περιοχές ITS1 και ITS2 καθώς και η περιοχή του 5.8S RNA γονιδίου του ριβοσωμικού DNA πολλαπλασιάσθηκαν με τη βοήθεια των εκκινητών ITS-1 (5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3) και ITS-4 (5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3) (White et al. 1990). Το προϊόν της PCR για κάθε απομόνωση καθαρίστηκε με τη βοήθεια του Qiaquick PCR Purification Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Germany) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Τα προϊόντα του καθαρισμού υποβλήθηκαν σε αμφίδρομη αλληλούχιση με τη βοήθεια των ITS-1 και ITS-4. Οι αλληλουχίσεις πραγματοποιήθηκαν από την εταιρία Lark Technologies Inc (Essex, UK).
Επεξεργασία δεδομένων αλληλούχισης: Η επεξεργασία των αποτελεσμάτων της αλληλούχισης πραγματοποιήθηκε με τη βοήθεια των προγραμμάτων Clustal W 2.0.9 (Larkin et al., 2007) και BioEdit 7.0.9.0 (Hall, 1999).
Ταυτοποίηση παθογόνων μυκήτων: Οι αλληλουχίες που προέκυψαν συγκρίθηκαν με τις αλληλουχίες της βάσης δεδομένων NCBI με τη χρήση του BlastN 2.2.18 (Zhang et al., 2000), ενώ ακολούθησε και η κατάθεση τους στο Ευρωπαϊκό Ινστιτούτο Βιοπληροφορικής (EMBL-EBI) από όπου δόθηκαν αριθμοί κατάθεσης για κάθε μια από τις απομονώσεις των φυτοπαθογόνων μυκήτων.
Η επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων πραγματοποιήθηκε με τη εφαρμογή των κανόνων του Koch. Η παθογόνος ικανότητα των απομονώσεων ελέγχθηκε με τη βοήθεια τεχνητών μολύνσεων σε 5 ώριμους καρπους ροδιού (cv. Kampatika). Τα παθογόνα απομονώθηκαν ξανά από τους σηπόμενους φυτικούς ιστούς οι οποίοι φανέρωσαν συμπτώματα σήψης ταυτόσημα με τους καρπούς από τους οποίους συλλέχθηκαν αρχικά.

Αποτελέσματα
Τα αποτελέσματα της ταυτοποίησης έδειξαν ότι οι προσβολές οφείλονταν στους μύκητες Botrytis cinerea Pers.:Fr., Penicillium glabrum (Wehmer) Westling, Aspergillus niger var. tubingensis (Schober) Mosseray και Pilidiella granati (Sacc.).
Πιο συγκεκριμένα:
Προσβεβλημένοι καρποί από το μύκητα Botrytis cinerea εμφάνιζαν εξωτερικά σκούρες καστανές κηλίδες ενώ εσωτερικά καστανή σήψη με γκρίζο μυκήλιο και κονιδιοφόρους. Το φυτοπαθογόνο Botrytis cinerea Pers.:Fr. απομονωνόταν συνεχώς από τους σηπόμενους ιστούς. Η ταυτοποίηση του μύκητα βασίστηκε στα μορφολογικά του χαρακτηριστικά. Πιο συγκεκριμένα, οι αποικίες του μύκητα ήταν αρχικά άχρωμες ενώ στη συνέχεια γκριζοκάστανες με κονίδια διαστάσεων 7.5 × 9μm. Τα σκληρώτια ήταν μαύρα ακανόνιστα σε σχήμα και μέγεθος με διαστάσεις 1.4 - 4.5 × 1.5 - 2.7 mm (Hewitt 1994). 
 
Οι προσβολές καρπών ροδιού από Penicillium glabrum, εμφάνιζαν, εξωτερικά, πράσινους κονιδιοφόρους στην περιοχή του κάλυκα. Εσωτερικά εμφανιζόταν μια καστανή μαλακή σήψη η οποία γρήγορα καλυπτόταν από πράσινο μυκήλιο και κονιδιοφόρους. Η ταυτοποίηση του μύκητα βασίστηκε στα μορφολογικά του χαρακτηριστικά (Thom and Raper, 1949) και στην αλληλούχιση των αμετάφραστων περιοχών ITS1 και ITS2 καθώς και της περιοχή του 5.8S RNA γονιδίου του ριβοσωμικού DNA. Ο αριθμός κατάθεσης της αλληλουχίας στο Ευρωπαϊκό Ινστιτούτο Βιοπληροφορικής (EMBL-EBI) είναι: Gene Bank Accession No FN313540
 

Τα συμπτώματα σήψης από Aspergillus niger var. tubingensis ήταν: καστανή εκτεταμένη σήψη (εξωτερικά), μαλακή καστανή σήψη με μαύρους κονιδιοφόρους (εσωτερικά). Η ταυτοποίηση του μύκητα βασίστηκε στα μορφολογικά του χαρακτηριστικά (Thom and Raper, 1945) και στην αλληλούχιση των αμετάφραστων περιοχών ITS1 και ITS2 καθώς και της περιοχή του 5.8S RNA γονιδίου του ριβοσωμικού DNA. Ο αριθμός κατάθεσης της αλληλουχίας στο Ευρωπαϊκό Ινστιτούτο Βιοπληροφορικής (EMBL-EBI) είναι: Gene Bank Accession No FN313541. 


Οι προσβολές από Pilidiella granati  εμφάνιζαν εκτεταμένη μαύρη σήψη εξωτερικά και εσωτερικά του καρπού. Σε οξινισμένο PDA ο P. granati παράγει λευκό έως υποκίτρινο μυκήλιο με άφθονα πυκνίδια ποικίλου μεγέθους. Ο μύκητας παράγει υαλώδη έως ελαφρώς καστανά κονίδια με το λόγο μήκος/πλάτος >1.5 σε αντίθεση με απομονώσεις του γένους Coniella οι οποίες παράγουν σκούρα καστανά κονίδια με το λόγο μήκος/πλάτος <1.5 . Η ταυτοποίηση του μύκητα βασίστηκε στα μορφολογικά του χαρακτηριστικά (Van Niekerk et al., 2004) και στην αλληλούχιση των αμετάφραστων περιοχών ITS1 και ITS2 καθώς και της περιοχή του 5.8S RNA γονιδίου του ριβοσωμικού DNA. Ο αριθμός κατάθεσης της αλληλουχίας στο Ευρωπαϊκό Ινστιτούτο Βιοπληροφορικής (EMBL-EBI) είναι: Gene Bank Accession No FR686354.


Σύμφωνα με την υπάρχουσα γνώση, είναι η πρώτη φορά που οι μύκητες Botrytis cinerea Pers.:Fr., Penicillium glabrum (Wehmer) Westling, Aspergillus niger var. tubingensis(Schober) Mosseray και Pilidiella granati (Sacc.), αναφέρονται ως αίτια προσυλλεκτικών και μετασυλλεκτικών σήψεων σε καρπούς ροδιάς στην Ελλάδα.
 

Δεν υπάρχουν σχόλια:

Δημοσίευση σχολίου