Στα δείγματα που προσκομίζονται στο εργαστήριο γίνεται μικροσκοπική παρατήρηση των συμπτωματικών φυτικών δειγμάτων, για διαπίστωση της παρουσίας τυχόν σημείων της ασθένειας στους προσβεβλημένους φυτικούς ιστούς, ως πρώτο βήμα ταυτοποίησης της αιτιολογίας της ασθένειας. Ακολούθως και με βάση τα ευρήματα των μικροσκοπικών παρατηρήσεων θα γίνεται επιλογή κατάλληλου θρεπτικού υποστρώματος για την απομόνωση των φυτοπαθογόνων μυκήτων. Θα χρησιμοποιηθούν κατά περίπτωση θρεπτικά υποστρώματα ευρείας και γενικής χρήσης όπως το Potato Dextrose Agar (PDA) αλλά και εκλεκτικά υποστρώματα (PPA, CMA) για την απομόνωση παθογόνων όπως μύκητες του γένους Phytophthora, Rhizoctonia, Pythium, Verticillium, Armillaria, Fusarium κ.α. Δεδομένου ότι ένα από τα πιο συχνά προβλήματα που ανακύπτουν σε προσπάθειες απομόνωσης φυτοπαθογόνων μυκήτων από δείγματα προσβεβλημένων ριζών είναι η ανάπτυξη και σαπροφυτικών οργανισμών στο υπόστρωμα, για επιλεγμένο αριθμό αντιπροσωπευτικών στελεχών, γίνεται εφαρμογή των κανόνων του Koch. Ακολουθεί η ταυτοποίηση των φυτοπαθογόνων στελεχών με βάση τα μορφολογικά χαρακτηριστικά των αποικιών στο θρεπτικό υπόστρωμα καθώς και τα μορφολογικά χαρακτηριστικά των καρποφοριών τους.
Οι απομονώσεις φυτοπαθογόνων μικροοργανισμών που προκύπτουν - κάθε φορά – καλλιεργούνται σε υγρά θρεπτικά υποστρώματα (Potato Dexrose Broth, Czapek Yeast Extract) με σκοπό την παραλαβή μυκηλίου και την απομόνωση DNA. Στη συνέχεια με τη βοήθεια της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (PCR) και συγκεκριμένων εκκινητών που στοχεύουν στο ριβοσωμικό DNA (ITS1 & ITS4 primers), πραγματοποιείται η αλληλούχιση των μη μεταγραφόμενων περιοχών του ριβοσωμικού DNA (rDNA – ITS). Η απομόνωση αυτών των περιοχών, η αλληλούχισή τους και σύγκρισή τους με τις υπάρχουσες αλληλουχίες σε παγκόσμιες βάσεις δεδομένων (GenBank) οδηγεί στην ταυτοποίηση των φυτοπαθογόνων μικροοργανισμών που απομονώνονται από τα συμπωματικά τμήματα των προσβεβλημένων φυτών.
Δεν υπάρχουν σχόλια:
Δημοσίευση σχολίου